生物醫學科研工作者的科研基本離不開抗體，WB（western blot）,IP(immunoprecipitation), IHC(immunohistochemical 免疫組化),IF(immunofluorescence 免疫熒光),ChIP(Chromatin immunoprecipitation)，FC(flowcytometry 流式細胞) 都需要用到抗體，那么這幾種實驗方法中的抗體有什么區別呢？

我們在CST上面找p53的抗體，得到了如下的頁面

可以看出p53抗體有很多種，并且每種抗體能做的實驗還都不一樣，那么為什么不同的抗體能做的實驗不一樣呢？這要從抗體是如何制備的開始。

1. 如何才能成為一個優秀的抗原？

制備抗體之前最重要的是如何制備抗原。一個良好即優秀的抗原應該具備的素質是

a. 分子足夠大。 我們知道抗原與抗原之間的區別是由抗原決定族決定的，抗原決定族又叫做表位（epitope），這些表位通常是由6-8個氨基酸組成的。而且要5-10kD才有一個表位，所以一些分子量太小的蛋白質或者多肽很難有一個表位的，也很難作為一個合格優秀的抗原。注意表位有兩種形式，一種是線性表位，即由氨基酸的序列決定的。另外一種是構象表位，是由氨基酸的空間結構決定的。兩個相隔很遠的氨基酸序列在空間結構上靠在一起可以形成一個結構表位。

b. 外源性強。我們常常將抗原注射到動物內體得到抗體，因此抗原必須要與該動物體內的成分區別性大，因為動物對自身的物質形成了免疫耐受，如果抗原與動物自身的物質非常相似，則很難引起強烈的免疫應答，也很難得到好的抗體。

c. 結構盡量復雜。有些物質即使分子量很大也不能算是一個合格的抗原，比如明膠分子量特別大，也屬于外源性強的物質。但是明膠的氨基酸基本上是直鏈的氨基酸，在體內容易被降解，類似的淀粉、核酸、多聚賴氨酸也是一樣，不是一個合格的抗原。

2. 制備抗體中常用獲得抗原的方式有哪些？

a. 人工合成多肽。很多家族蛋白相似度很高，比如actin家族中 a-actin, b-actin, r-actin三者之間非常相似，基本上只差幾個氨基酸，而這些差別的氨基酸往往還被包裹在內部。因此只有人工合成這些差別的序列多肽，才可能區分開這三種相似的蛋白質。制備出來的抗體大部分是識別線性結構的蛋白質。

b. 純化的重組蛋白。重組蛋白比較容易獲得，而且能夠獲得比較高的純度。但是在重組蛋白中我們為了純化往往要加入一段標簽（比如GST， His, Flag等），拿這些帶有標簽的重組蛋白去免疫動物，自然也會得到對標簽識別的抗體。我們常常用His作為標簽，因為它比較小，而且免疫原性比較弱，產生的抗體可以忽略。制備的抗體可以識別線性結構的蛋白質，也可以識別天然折疊狀態下的蛋白質。

c. 純化的天然蛋白。天然蛋白存在修飾，結構復雜，因此是用來做抗體zui 好的抗原。但是很遺憾天然蛋白很難達到較高的純度。制備出來的抗體*是識別天然狀態下的蛋白質，對線性結構的也能識別。

3. WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC之間對抗體需求有什么區別？

在理解上面技術對抗體需求的區別之前我們首先要知道這些實驗技術都需要什么樣的抗體。

a. WB. WB的蛋白經過加熱變性之后都變成線性的結構。因此zui 好的抗體是采用非常特異序列的人工合成多肽的方法來做實驗，結果也非常特異。

b. IP/CHIP. 我們用抗體去結合生理狀態下的蛋白質，因此IP的抗體最好使用純化的天然蛋白制作的抗體來做，也可以用純化的重組蛋白的抗體。最好不要用人工合成多肽制作的抗體，因為這種抗體識別的位點可能被深深地藏在了蛋白的內心深處。CHIP和IP沒有太大的區別，wei一的問題在于，如果抗體識別的表位和該蛋白質與DNA結合的部位一致，則會導致CHIP實驗的失敗。

c. IF/IHC. 免疫熒光和免疫組化中需要進行固定一步，固定是為了盡量讓細胞的形態結構維持和原有的一致。這種化學物質的固定使蛋白質變性凝固，與天然狀態下的蛋白質有了一定的區別，但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結構。因此在做IF/IHC實驗中，最合適的抗體可以是純化的重組蛋白得到的抗體，也可以是人工合成多肽得到的抗體（多肽是在蛋白質的表面）

d. FC. 流式細胞中分為兩種，一種是活細胞的流式，這種流失最好采用是天然蛋白或者重組蛋白的抗體來做，另外一種是經過固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗體一致。 在做流式細胞中，我們有直接標記和間接標記，間接標記不如直接標記真實準確。因此我們選擇流式抗體要采用帶有熒光標記的抗體；如果研究的蛋白沒有直接標記的抗體，那么就采用間接標記抗體，需要添加熒光二抗。

4. 常見的問題

a. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎？

不一定能通用。流式是用直接標記還是間接標記？如果是直接標記的話，那這個抗體一般不是FITC標記或者就是TRITC，PE之類的。如果恰好你的免疫組化，也是想用熒光素標記的抗體來直接標記，那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標記的話，或者是間接標記的話，就有麻煩，因為熒光素的標記很可能會影響二抗和一抗的結合。

b. 為什么我的抗體做WB非常好，而做不了IF，IHC等其他任何實驗？

首先恭喜你有一個WB非常好的抗體，畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次，你這個抗體很可能是通過人工合成多肽得到的，和上面所述，你用來做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質的中心，因此只能識別WB中線性的部分。

c. 如何選擇免疫組化抗體？

首先，一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體，單克隆抗體特異性強，靈敏度低；多克隆抗體靈敏度高，特異性弱。根據你的實驗結果，如果非特異多，那么選擇單克隆抗體；如果陽性信號弱，不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來源的都是多克隆，小鼠來源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識別什么種屬的抗原，抗體說明書上面一般注明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人Hum。再次比較重要的是要注意一抗的來源。比如我們在人的癌組織中做p53的免疫組化，一抗我們采用的是小鼠來源的p53抗體，那么二抗我們一定要選擇 抗小鼠的二抗比如（山羊抗小鼠，兔抗小鼠），這一點非常重要。最后，一般的抗體說明書都會注明能做什么實驗，如果標明了不可以做免疫組化，一定不要選擇；反過來說，即使標明了可以做免疫組化，也不一定能夠做，商家只會夸大其效果。

d. WB和IF的二抗是一樣的嗎？

很明顯，不是！免疫熒光抗體是用于 免疫熒光試驗的，是用FITC或PE等標記的抗體，結果需要紫外線激發并用熒光顯微鏡觀察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標記的抗體，需顯色底物（如OPD\TMB等）直接顯色（肉眼）或化學發光法顯影（需特殊儀器）。

e. 做CHIP的抗體是否可以用來做WB抗體？

不一定，一般來說做CHIP級別的抗體對抗體純度特異性方面都要求比較高，基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識別的是構象表位（比如是由兩個實際靠在一起但變為線性結構之后相隔很遠的兩端序列），而不是線性表位，這種CHIP抗體做不了WB。

f. 抗體說明書上面沒有寫該抗體能夠用于某項實驗怎么辦？

一般而言，抗體研發出來之后都要經過WB，IP，IF，IHC實驗。檔發現濃度不夠做IF，IHC時候，國外的抗體一般都是寫未檢測，國內的抗體一般是不寫。所以盡量不要抱著試試的心里去嘗試，往往只會浪費時間。你想啊，如果抗體能夠做該實驗，他們肯定會寫上去啊。

g. 做ELISA的抗體能否用來做WB？

通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000，IF/IHC為1:100，而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個抗體用來做ELISA的，那么言外之意就是該抗體效價不高。但不是說ELISA的抗體不能用于做WB，抗體說明書提示做ELISA稀釋比例為1:1000，那么你可以試試1:100做做WB。